DNA高通量测序技术被广泛应用于生命科学研究中，是基因表达分析，遗传组学分析，表观遗传组学分析等多种组学研究的必要手段和方法。在使用二代高通量测序技术时，传统建库方法通常使用超声打断或酶消化的方式将目标DNA片段化，之后通过连接反应将特定序列引物连接到片段化DNA上，进而PCR扩增得到测序文库[1]。
自Tn5转座酶在大肠杆菌中发现以来，多被用于片段化并标记双链DNA和RNA/DNA杂交链[2]。转座酶能在片段化目标DNA的同时将转座子DNA插入目标序列，从而产生可以直接PCR扩增建库的DNA片段[3,4]（图1）。与传统方法相比，合并了DNA打断和接头连接的过程，大大缩短了建库时间并提高了文库构建效率。因此，Tn5已被应用于多种高通量测序方法。
2023年4月4日，我院方东实验室在Genome Research杂志发表题为“Tn5 tagments and transports oligos to single-strand DNA for strand-specific RNA sequencing”的论文，提出了Tn5转座子可片段化并标记单链DNA的功能，并在此基础上开发了具有链特异性的单链DNA测序方法（图1）。
图1. Tn5可以切割多种形式的核酸序列。
图中以翻花绳比如Tn5对核酸的切割。两个小朋友比喻两个Tn5蛋白，花绳象征不同形式的核酸分子。
为探究Tn5如何作用于不同的核酸底物，研究者以双链DNA，单链DNA，RNA链，DNA/RNA杂交链分别作为底物进行实验，发现Tn5可以片段化单链DNA。机制探索发现Tn5转座子在转座单链DNA时，将转座子DNA插入单链DNA的5’端。研究者据此开发了一种新的单链DNA的链特异性高通量测序方法，命名为TABLE-seq (a tagmentation-based and ligation-enabled single-strand DNA sequencing method)。
研究者设计了特殊的3’端DNA接头，用于连接到被Tn5转座子片段化后的单链DNA的3’端。该特殊设计的接头的由两条寡聚核苷酸链退火组装而成：一条DNA链的5’增加磷酸化修饰，用于连接单链DNA；另一条互补链的3’端包含6个延伸的随机DNA碱基，增加与目标DNA互补配对效率，并且在末端再添加一个反向dT碱基，以防止错误延伸。该特殊设计的接头连接到Tn5切割后的单链DNA的3’端，从而得到双端具有特异序列接头的单链DNA模板，之后可通过PCR扩增得到链特异性的DNA文库，用于高通量测序。
在此基础上，课题组将该技术应用于常用的链特异性RNA高通量测序。使用RNA反转录后的单链cDNA为起始底物，通过TABLE-seq方法构建测序文库。相比于传统的dUTP-seq测序方法，此方法无需UDGase消化第二链模板，即可得到链特异性的扩增模板。两种测序方法对比实验显示，TABLE-seq方法可以检测到更多的基因，且具有更高的链特异性，同时测序结果在基因区域的分布更加均匀。
本研究发现并利用了Tn5转座子片段化并标记单链DNA的活性，开发了新的单链DNA链特异性测序方法，拓展了Tn5转座子在高通量测序中的应用。
华体会网址网页版,登录入口博士研究生张燕君、唐寅为本文共同第一作者，方东研究员为本文通讯作者。
参考文献
[1] Oyola SO, Otto TD, Gu Y, Maslen G, Manske M, Campino S, Turner DJ, Macinnis B, Kwiatkowski DP, Swerdlow HP et al. 2012. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics 13: 1.
[2] Sun Z, Tang Y, Zhang Y, Fang Y, Jia J, Zeng W, Fang D. 2021b. Joint single-cell multiomic analysis in Wnt3a induced asymmetric stem cell division. Nat Commun 12: 5941.
[3] Adey A, Morrison HG, Asan, Xun X, Kitzman JO, Turner EH, Stackhouse B, MacKenzie AP, Caruccio NC, Zhang X et al. 2010. Rapid, low-input, low-bias construction of shotgun fragment libraries by high-density in vitro transposition. Genome Biol 11: R119.
[4] Hennig BP, Velten L, Racke I, Tu CS, Thoms M, Rybin V, Besir H, Remans K, Steinmetz LM. 2018. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3 (Bethesda) 8: 79-89.
原文链接：https://genome.cshlp.org/content/33/3/412.full
